Uczelnia miała być przeznaczona głównie dla szlachty, ale wbrew intencjom fundatora jej charakter zmienił się szybko ze szlacheckiego na mieszczański.15 marca 1594
Przekładając na współczesne realia kanclerz Jan Zamoyski miliarderem był. Tyle, że swoje znaczenie, wpływy i potęgę podkreślał inaczej niż współcześni miliarderzy. Nie tylko założył miasto, ale postanowił zapisać się w pamięci potomnych kształceniem młodych Polaków. I właśnie w tym celu ufundował Akademię Zamojską pierwszą prywatną uczelnią w Rzeczypospolitej, w całości opłacaną przez wielkiego kanclerza, będąc symbolem potęgi i ambicji fundatora. Oficjalne otwarcie Akademii nastąpiło 15 marca 1594 roku.
To właśnie w akcie fundacyjnym uczelni z 1600 zawarte zostały powszechnie znane słowa kanclerza Zamoyskiego: „Takie są rzeczypospolite, jakie ich młodzieży chowanie”. W planach kanclerza Akademia miała być prężnym ośrodkiem kultury polskiej i katolickiej, który oddziaływałby silnie na ludność prawosławną, przeważającą w województwach południowo-wschodnich.
W pierwszej dekadzie swojego istnienia (do śmierci hetmana), Akademia zdobyła sobie znaczny rozgłos nie tylko w Polsce, ale także w całej Europie. Dzięki niej Zamość na przełomie XVI i XVII wieku był jednym z głównych ośrodków myśli naukowej w Polsce.
Na początku działalności Akademii Zamojskiej istniały trzy wydziały: filozoficzny, medyczny, prawniczy. Zajęcia prowadziło 15 profesorów, m.in. Melchior Stefanides (pierwszy rektor; logika, metafizyka, prawo), Wawrzyniec Starnigel, Adam Burski (filozof), Tomasz Drezner (prawnik), Jan Niedźwiecki-Ursinus (medyk i twórca podręcznika gramatyki łacińskiej „Methodicae grammaticae libri IV”), Maciej Jaworowski (prawo, filozofia), w późniejszym okresie także Stanisław Staszic. Wykłady odbywały się po grecku i łacińsku.
W założeniach kanclerza Zamoyskiego uczelnia miała być przeznaczona głównie dla szlachty, ale wbrew intencjom fundatora jej charakter zmienił się szybko ze szlacheckiego na mieszczański. W latach 1607–1609 młodzież pochodzenia szlacheckiego stanowiła zaledwie 5% spośród 237 przybyłych wówczas studentów, zaś najliczniejszą grupą studentów byli mieszczanie. Po pierwszym rozbiorze Polski w 1772 Zamość wraz z Akademią trafiły pod władanie austriackie. Ostatnim rektorem uczelni był Dominik Rydulski, który zabiegał o utrzymanie uczelni u przebywającego w 1773 roku w Zamościu cesarza Józefa II. W roku 1784 działalność Akademii została zakończona.
